離心柱法主要是利用離心柱中的硅膠基質(zhì)吸附RNA，再通過洗滌去除雜質(zhì)從而得到RNA的一種常用方法。相較于Trizol法，離心柱法因操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、純度高等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，但也因其吸附柱規(guī)格的限制在大批量操作時(shí)具有一定的局限性，此外，針對(duì)特殊的樣本，其提取的效果也大不如Trizol法好。那么你知道柱式法RNA提取的實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)是什么嗎？讓我們一起來看看吧！
 

　　一、主要的試劑、儀器與耗材
 

　　RNA提取試劑盒、氯仿、無水乙醇、RNase free Water、低溫冷凍離心機(jī)、勻漿器或組織研磨器、微量移液器、通風(fēng)櫥、計(jì)時(shí)器、1.5ml EP管、2ml EP管等。
 

　　二、 提取步驟
 

　　1.樣品處理：
 

　　· 細(xì)胞：貼壁細(xì)胞每106細(xì)胞加入1ml裂解液，吹打混勻。
 

　　· 懸浮細(xì)胞：植物、動(dòng)物、酵母每10^6細(xì)胞加入1ml裂解液。
 

　　· 細(xì)菌細(xì)胞每107細(xì)胞加入1ml裂解液混勻。
 

　　· 組織：新鮮或-70℃凍存100mg組織加1ml裂解液，勻漿處理。
 

　　2.室溫放置5min，使核酸蛋白復(fù)合物分離；
 

　　3.向勻漿樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置3-5min；
 

　　4.2-8℃，12000rpm離心10min。RNA主要存在于上層水相中把水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中(注：不可吸到沉淀)；
 

　　5.吸附柱前處理：在吸附柱中加入500ul洗柱液，室溫放置2min，2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液(小Tips：此步可以在第四步離心還剩2min左右的時(shí)候進(jìn)行，這樣第四步離心結(jié)束就可以直接進(jìn)行洗柱，而不需要再等時(shí)間)；
 

　　6.在收集的上清中加入200ul無水乙醇混勻，加入吸附柱中靜置2min，2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液；
 

　　7.向吸附柱中加入600ul漂洗液(注：新買的試劑盒中漂洗液還需要加入一定量的無水乙醇，此步一定要確認(rèn)漂洗液是否加入無水乙醇)，2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液；
 

　　8.向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液(注：漂洗液在7-8步共加了兩次哦)；
 

　　9.12000rpm離心2min，棄掉收集管，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘(10-15min)以去除殘留的漂洗液(注：最好在通風(fēng)櫥進(jìn)行，以免RNA酶對(duì)RNA的降解；通風(fēng)櫥在使用前也可先紫外30min)；
 

　　10.將吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O(通常取中間值)，室溫放置5min，12000rpm室溫離心2min即可得到RNA溶液(注：所有步驟中僅最后一步離心是在室溫，其余均在2-8℃，因此，前幾步離心拿出樣品后一定要及時(shí)關(guān)上離心機(jī)蓋子，以免升溫，而在第9步離心結(jié)束后就可以打開離心機(jī)蓋子使其快速升至室溫)。
 

　　三、 注意事項(xiàng)
 

　　1.佩戴手套、口罩，消毒操作臺(tái)，杜絕外源酶的污染；
 

　　2.所用試劑耗材必須無酶化，有條件者可以直接購買，否則就要做好高壓滅菌的工作；
 

　　3.得到RNA溶液后可保存于-80℃，避免反復(fù)凍融，放置時(shí)間不可過長(zhǎng)；4.對(duì)于組織RNA的提取，一定要充分勻漿處理以使RNA充分釋放出來。
 

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